کارگاه Real Time PCR

کارگاه Real Time PCR

 
گروه ژنتیک پزشکی نیاژن نور برای برگزاری کارگاه های آموزشی  در زمینه چگونگی اجرا و تفسیر تکنیک Real time PCR بصورت انفرادی و گروهی، آمادگی دارد.
همچنین  امکان پذیرش نمونه برای اجرا یا تفسیر تست های بر پایه تکنیک Real time PCR را از آزمایشگاه ها، مراکز پژوهشی و دانشگاهی میباشد. لطفا" برای کسب اطلاعات بیشتر با تلفن های شرکت تماس حاصل نمایید.
 
معرفی روش Real time PCR:
این روش آزمایشگاهی (Real time PCR) به منظور تشخیص تعداد نسخه های ژنتیکی (حذف و اضافه شدگی ها)  و بررسی وجود جهش های احتمالی در نمونه های مورد آزمایش انجام می گیرد.
این تکنیک از جهاتی بسیار شبیه به روش PCR معمولی بوده مانند استفاده از پرایمرهای اختصاصی یا نیاز به توالی الگو و... اما به دلیل بررسی کمی جایگاه مورد نظر تفاوت های عمده ای نیز با PCR معمولی دارد. در روش ریل تایم مانند بسیاری از روش های بررسی کمی ژنوم مانندQF-PCR   یا MLPA از پرایمرهای فلورسانت استفاده می گردد تا میزان کمی الگوی مورد نظر ارزیابی گردد.
 
در روش Real time PCR نشانگرهای فلورسانت به گونه ای طراحی شده اند که در صورت اتصال به توالی تکثیر یافته DNA تولید نور می کنند و شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول تولید شده نسبت مستقیم دارد.
روش Real time PCR  به دو صورت انجام می شود:
روش اول که دقت پایین تری دارد و بیشتر برای بررسی کیفی جایگاه مورد نظر استفاده می شود، SYBR® Green گفته می شود. 
 
                                                           
در این روش به محض تکثیر توالی DNA ، نشانگرهای فلورسنت غیر اختصاصی بعنوان گزارشگر به مارپیچ DNA تکثیرشده متصل شده و تولید نور می نمایند و نور ایجاد شده توسط دستگاه قابل ثبت است. نکته قابل تامل این است که رنگ های مورد استفاده (سایبرگرین)  توانایی اتصال به تک رشته را نداشته و شدت نور اتساع شده میزان تکثیر DNA را نشان می دهند  و در واقع این انتشار نور فلوروسنت در سیکل های متوالی بر اثر مضاعف شدن محصول PCR افزایش می یابد. 
                                                         
روش دوم ریل تایم که اختصاصیت بالاتری دارد با استفاده از نشانگرهای فلورسنت اختصاصی و با بکارگیری از پروب هایی برای ژن هدف است. شایع ترین شناساگرهای  الیگونوکلئوتیدی مورد استفاده (پروب ها) شامل TaqMan®  ، Scorpion® Primers و Molecular Beacons FRET Hybridization Probes می باشند.
 
                                                                 
در ذیل خلاصه ای از روند آزمایش ریل تایم که در شرکت نیاژن نور انجام می گیرد توضیح داده می شود؛ 
                                    
فرآیند انجام آزمایش
• نمونه گیری و استخراج DNA
1)پذیرش و تشکیل پرونده برای نمونه ارجاعی
2) حداقل میزان نمونه خون 2 میلی لیتر در لوله EDTA
3)استخراج DNA از نمونه با روش Salting Out Proteinase K
5) بررسی غلظت و کیفیت نمونه ی DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه نانودراپ
6)در صورت مناسب بودن غلظت DNA(حداقل 20ng/µl) و کیفیت آن(OD 260/280≥ 1.8)و  (OD 260/230> 1.5)، جهت استفاده در آزمایش، نمونه ی DNA را با استفاده از فرمول N1V1=N2V2 رقیق میکنیم تا به غلظت 20ng/µl برسد.
7) تهیه ی محلول واکنش Real time PCR با توجه به ست آپ کارشناسان گروه نیاژن نور
8) برای هر Run میکروتیوب های محتوی محلول واکنش را به آرامی با میکروتیوب ها مخلوط و سپس Spin  نموده و در استریپ های مخصوص دستگاه به مقدار مورد نظر توزیع می نماییم. در پایان DNA template را به محلول واکنش اضافه می کنیم.
9) بعد از آماده شدن نمونه، برنامه ی مورد نظر برای آزمایش را در دستگاه Real time PCR Step one Plus  وارد نموده و نمونه ها را در دستگاه قرار می دهیم.
 
                                                                
 
در این مرحله با انتخاب گزینه ی  Plate Set up صفحه ای باز می شود که محتوی 2 بخش شامل:
Define Targets and Samples و Assign Targets and Samples
1. ابتدا در بخش Define Targets and Samples  نام ژن های هدف (Target)، مرجع (Reference) و وجود یا عدم وجود Reference Dye)ROX) را مشخص می کنیم
 
                                   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
بر اساس Master Mix و Tm پرایمرهای مورد استفاده، سیکل دمایی مورد نظر برای هر مرحله را در قسمت مربوطه تعیین می کنیم
نکته: باید توجه داشت که هنگام برنامه دادن به دستگاه:
1. حتما گزینه ی AutoDeltaEnable فعال شده باشد
2. حتما گزینه ی Data Collection نیز در مرحله ی آخر (Extension) فعال باشد
 
 
 آنالیز نتایج:
از روی نمودار نشان داده شده در دستگاه روند تکثیر ژن هدف (Target gene) قابل مشاهده است و میتوان انجام شدن واکنش PCR را در لحظه (علت انتخاب نام این تکنیک نیز بر این اساس است) از روی این نمودار بررسی نماییم. در این نمودار محور افقی نمایانگر تعداد سیکل و محور عمودی نیز نشان دهنده ی شدت فلورسنت می باشد. به طور معمول پس از اتمام روند PCR با توجه به مقادیر مربوط به Ct آنالیز را انجام می دهیم. مفاهیم مورد استفاده در بررسی و آنالیز نتایج Real time PCR به شرح ذیل می باشد:
1. Baseline : سیگنال های فلورسنت در سیکل های اولیه می باشد که توسط دستگاه ثبت می شود و نشان دهنده ی مراحل آغازین تکثیر ژن مورد نظر می باشد و هنوز مقدار محصول تولید شده در حد شناسایی توسط دستگاه نمی باشد.
2. Threshold : آستانه ای از سیگنال فلورسنت می باشد که نشان دهنده ی افزایش معنی دار سیگنال فلورسنت نسبت به حالت Baseline است. مقدار آستانه به صورت از پیش تعیین شده درنرم افزار دستگاه تعریف شده است و قابل ذکر می باشد که حد آستانه توسط اپراتور قابل تغییر می باشد. (جهت مشاهده ی خط آستانه گزینه ی Threshold  در پایین صفحه ی نمودار Amplification Plot باید فعال شده باشد) 
3. Ct )Cross Threshold): نشان دهنده ی اولین سیکلی است که سیگنال فلورسنت آن از حد آستانه عبور می کند. این مقدار با شماره ی سیکل مورد نظر مشخص می شود. مقدارCt  با تعداد نسخه اولیه ی ژن هدف رابطه ی معکوس دارد.
                                   
 
آنالیز نمودار ذوب (Melt Curve):
این نمودار به منظور بررسی وجود آلودگی درواکنش  PCR، وجود دایمر پرایمر و تعیین اختصاصیت محصول تولید شده از ژن مورد نظر میباشد. به طوری که وجود محصول غیر اختصاصی به صورت نمودار ذوب متفاوت با محصول اصلی نمایان می شود. در این نمودار محور افقی نمایانگر مقدار Tm محصول و محور عمودی نشان دهنده ی میزان فلورسنت می باشد.
منظور از Tm دمایی است که در آن نیمی از محصول PCR به صورت دو رشته و نیمی دیگر به صورت تک رشته می باشد. قابل ذکر است که بسته به طول محصول تولید شده و محتوای بازهای G و C میزان Tm می تواند افزایش یا کاهش داشته باشد. 
 
                              
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
درصورت درخواست ارائه خدمات  Real Time PCR و برگزاری کارگاه های انفرادی لطفا با شماره تلفن های شرکت تماس حاصل فرمائید.