MLPA (خوانش و انجام کامل تست)

MLPA (خوانش و انجام کامل تست)

گروه ژنتیک پزشکی نیاژن نور افتخار دارد در جهت طراحی پنل، خوانش و آنالیز MLPA به پژوهشگران و همکاران محترم ارائه خدمات نماید.

 

                                                 جدول خدمات MLPA

                          انجام MLPA بصورت کامل ( بر روی نمونه خون یا DNA)
                                     خوانش محصولات PCR حاصل از MLPA
                        انجام آنالیز نهایی انواع اختلالات مورد بررسی با تکنیک MLPA
                                         طراحی انواع پنل های  MLPA
               برگزاری کارگاه های انفرادی و گروهی آموزش  MLPA و چگونگی آنالیز
 

 

 اساس تکنیک MLPA  به  همراه چگونگی نحوه بررسی اختلال SMA 

 1.  روش (MLPA(Multiplex Ligation-dependent probe amplification
تکنیکMLPA   از جمله روش های مولکولی بوده که برای تشخیص جهش های طولی (حذف شدگی ها و اضافه شدگی ها) و گاه جهش های نقطه ای در ژن کاربرد دارد. تغییرات تعداد نسخه ژنی (CNV) و برخی جهش های نقطه ای در برخی بیماری های ژنتیکی انسان مشاهده شده است که با روش های بر پایه PCR مانند توالی یابی DNA یا تکنیک های ARMS, GAP-PCR, RFLP و غیره قابل تشخیص نمی باشند.  
در این روش نمونه DNA از جهت تعداد نسخه ژنی gene dosage مورد ارزیابی کمی قرار می گیرد و در هر واکنش PCR  می توان تقریبا" 50 محل یا بیشتر را بررسی کرد. در این روش با طراحی مجموعه ای از پروب ها که هر کدام مکمل ناحیه مشخصی از ژنوم می باشند، تعداد نسخه ژنی(deletion, duplication) در یک ناحیه از ژن کاندید را می توان مشخص نمود.
طیف بررسی این تغییرات نسخه ژنی از شناسایی یک نسخه اضافی از یک کروموزوم مانند سندرم های تریزومی در بررسی آنیوپلوئیدی ها تا حذف های تک اگزون مانند آنچه در اختلال دیستروفی عضلانی دوشن/بکر مشاهده می گردد متنوع می باشد.
ابزار مورد نیاز برای این تکنیک:
1. دستگاه ترموسایکلر
2. کیت تشخیصی MLPA خاص اختلال مورد بررسی
3. دستگاه ژنتیک آنالایزر برای خوانش فراگمنت
 
در MLPA، پروب ها به جای ژنوم تکثیر می شوند، پروب ها ژنوم مکمل را شناسایی کرده، هیبرید شده و سپس لیگاسیون رخ داده و تکثیر شروع می شود. این روش براساس پروب بوده (Probe Base) و در یک واکنش MLPA حدود 40-50 منطقه از ژنوم بطور همزمان از نظر تعداد نسخه موجود در ژنوم (Copy Number Variation=CNV ) بررسی می شوند، کیت MLPA در دو دسته تقسیم بندی می شود:
1) غربالگری (Screening) : در این کیت پروب هایی به منظور تشخیص بیماری های مختلف یا یک بیماری که ژن های موتانت (مسبب آن بیماری) روی کروموزوم های مختلف قرار دارند وجود دارد.
2) اختصاصی (Specific) : پروب ها در کیت اختصاصی فقط یک جایگاه ژنی یا یک ناحیه کروموزومی را بررسی می کنند. مانند پروب های تشخیصی آلفا تالاسمی.
طراحی پروب به گونه ای است که از سه قسمت مجزا تشکیل شده است؛ 
1) توالی مربوط به هیبرید شدن  (Hybridization Sequence )
این توالی که در تصویر ذیل به رنگ آبی مشخص شده است، ژنوم مکمل را شناسایی می کند و روی آن قرار می گیرد.
2) توالی مربوط به پرایمر و تکثیر (PCR Primer Sequence )
این توالی به رنگ مشکی مشخص شده است و در دو طرف پروب قرار گرفته است و جایگاهی برای اتصال یک جفت پرایمر Universal  می باشد.
3) توالی Stuffer  )Stuffer Sequence , Different for each Probe )
سومین قسمت پروب MLPA مربوط به قطعه Stuffer بوده که با رنگ سبز در تصویر نشان داده شده است. ویژگی اصلی این قطعه آن است که هیچ مکملی روی ژنوم نداشته و نمی تواند هیبرید شود. Stuffer برای آن است که قطعاتی با طول متفاوت داشته باشیم در نتیجه این قطعه از پروب برای کیت های متفاوت، طول های متفاوتی دارد که در نهایت Fragment  های متفاوتی ایجاد خواهد کرد. قسمتی از پروب (Hybridization Sequence) که بر روی ژنوم مکمل خود قرار می گیرد از نظر طول مشابه پروب های دیگر بوده و تنها تفاوت آنها در نوع نوکلیوتید ها در توالی مذکور است. در یک کیت ممکن است 50 پروب و در کیت دیگر 40 پروب وجود داشته باشد. 
مراحل MLPA: 
در MLPA پنج مرحله اصلی وجود دارد؛
1) Denaturation  (دناتوراسیون، باز شدن دو رشته):
در این مرحله ژنوم را در معرض دمای بالا (Hot) قرار داده تا دو رشته از هم باز شوند. معمولا" حدود 5 دقیقه DNA  را در دمای 98 درجه قرار می دهیم.
2) Hybridization  (هیبریداسیون) :
در این مرحله، در یک مدت زمان نسبتا" طولانی حدود 20-12  ساعت (میانگین 18 ساعت) به پروب ها اجازه می دهند تا نواحی مکمل خود را روی ژنوم پیدا کنند و هیبرید شوند. اگر هر دو تکه پروب نواحی مکمل خود را در ژنوم پیدا کنند بصورت انتها به انتها (End to End )نسبت به یکدیگر قرار می گیرند  و فقط اندازه یک پیوند فسفودی استر از هم فاصله دارند.
3)Ligation  (لیگاسیون، اتصال) :
به تیوب ها آنزیم لیگاز اضافه شده تا در این مرحله دو قسمت پروب به همدیگر متصل (Ligate) شوند.
سوال: چرا پروب ها دو تکه طراحی شده اند؟
 افزایش ویژگی و اختصاصیت: در اینجا اگر یک حذف کوچک چند نوکلیوتیدی  نیز در محل اتصال پروب ها باشد لیگاسیون  رخ نمی دهد و تنها پروب هایی وارد مرحله چهارم (PCR) می شوند که در امتداد یکدیگر قرار بگیرند.
 حذف مرحله شست و شو یا Washing: اگر پروب ها یک تکه طراحی می شدند،  مشخص کردن پروب متصل شده به ناحیه مکمل خود و پروبی که متصل نشده امکان پذیر نبود چون در هر دو حالت تکثیر صورت می گرفت، در نتیجه برای افزایش دقت و حساسیت در استفاده از پروب های یک تکه، پس از مرحله هیبریداسیون، یک مرحله Washing نیز اضافه شده بود تا مطمین از اتصال پروب تکثیری شوند.
4) PCR
5) جداسازی فرآورده های تکثیر شده:
پروب ها براساس سایز توسط دستگاه کاپیلاری (Genetic Analyzer) جدا می شوند.
 
آنالیز داده های خام:
در دستگاه کاپیلاری محل های مورد نظر بر اساس سایز از هم جدا می شوند و چون تنها رنگ مورد استفاده FAM  (آبی رنگ) است، اگر فردی در محل پروب مدنظر تغییری در ژنوم داشته باشد ارتفاع پیک در آن محل تغییر می کند.
 
 
 
 
 

چون  MLPAیک روش کمی است، می بایست حتما" نمونه ها را با یک جامعه نرمال مقایسه کرد.

سوال: چه تعدادجامعه نرمال نیاز است؟ 

اگر فقط یک فرد نرمال بعنوان استاندارد استفاده شود، نمی توان براساس یک نمونه قضاوت کرد، گاهی ممکن است آن محل در آن فرد خوب کار نکرده باشد پس باید چند فرد نرمال را براساس ویژگی های خاصی مانند سالم بودن از نظر اختلال مورد نظر غربالگری کرد و در مرحله آنالیز نیز دوباره Normalize  شوند.

به عنوان مثال اگر اختلال تالاسمی مورد بحث است، افرادی که CBC نرمال دارند ابتدا انتخاب می شوند اما  در مرحله آنالیز نیز Normalize  آن ها می بایست تایید شود. زیرا ممکن است به دلیل مصرف داروی خاص یا پروتیین ویژه ای که در بدن دارند MLPA آنها خوب کار نکند.

نکته 1: درصورتی که  MLPA برای مدتها در آزمایشگاه راه اندازی شده است، نتیجه حاصل از MLPA برای ما قابل قبول است اما در صورتی که کار تازه شروع شده می بایست نتیجه نهایی تفسیر شده را با Real Time  تایید کرد و در صورتی که در ژنوم بیمار حذف مشاهده شده باشد می بایست روی PCR Product  یک  PCRمجدد گذاشت که در صورت عدم تکثیر، تفسیر ما با  روش  MLPA صحیح بوده است. 

نکته 2: در یک MLPA Reaction  کمیت DNA مورد استفاده از استاندارد خاصی تبعیت نمی کند  و می توان از مقادیر  10 ng، 50 ng یا 750 ng استفاده نمود، اما مهم آن است که در تیوب تمام افراد مورد بررسی میزان DNA مشابهی ریخته شود چون اگر هر کدام از Sample  ها میزان DNA بیشتری داشته باشند در آنصورت احتمال اتصال غیر اختصاصی نسبت به بقیه نمونه ها بیشتر می شود.

 
 
 
 

MLPA (بررسی الگوی متیلاسیون)

از دیگر کاربردهای مهم MLPA می توان به بررسی نواحی  نشان گذاری شده (imprinted regions) اشاره کرد.

در واقع با روش MS-MLPA علاوه بر تغییرات تعداد نسخه (CNV)، می توان در همان reaction نواحی نشان گذاری شده ژنوم را نیز مورد بررسی قرار داد. اختلالات Prader-Willi / Angelman و Beckwidt-Wiedemann / RSS از جمله اختلالات ناشی از نقص در imprinting  هستند.  

سوال: آیا تغییر در ژنوم موجب بروز اختلالات ناشی از نقص در نشان گذاری شده است؟

در بیشتر موارد تغییرات اپی ژنتیکی در ایجاد این نوع اختلالات نقش دارند، هر چند گزارش هایی مبنی بر دخالت جهش های نقطه ای نیز وجود دارد. اگر بخواهیم بروز بیماری را از منظر اپی ژنتیک بررسی کنیم می بایست به این نکته اشاره کرد که؛ تنظیم اپی ژنتیکی رونویسی از ژن با تغییر در میزان متیلاسیون نوکلیوتیدهای CpG در CpG island ناحیه پروموتر ایجاد می شود. برای مثال هایپر متیلاسیون پروموتر ژن MGMT منجر به ایجاد تومور مغزی می گردد. الگوی متیلاسیون ژن ها از والدین به فرزندان منتقل شده و در بسیاری از موارد الگوی متیلاسیون آلل منتقل شده از پدر سالم با الگوی اپی ژنتیکی آلل دریافتی از مادر سالم تفاوت دارد. به این معنی که بیان ژن مذکور  Sex Influence (متاثر از جنس) می باشد. با کمک روش MLPA می توان این تغییرات اپی ژنتیکی مسبب بیماری را تشخیص داد.

MS-MLPA  در آزمایشگاه:

این تکنیک نسبت به MLPA روتین یک مرحله اضافه دارد به اینصورت که پس از مرحله هیبریداسیون و اطمینان از هیبرید شدن پروب ها به ژنوم از آنزیم Restriction استفاده می شود. در صورتی که ژنوم متیله باشد این آنزیم نمی تواند تاثیر بگذارد و PCR  انجام می شود اما در صورتی که ژنوم متیله نباشد این آنزیم در نواحی غیر متیله مذکور برش ایجاد کرده و در نتیجه PCR  رخ نمی دهد و در آن مناطق کاهش پیک داریم.

نکته 3: اختصاصیت پروب ها در MLPA در هنگام هیبریداسیون به حدی است که اگر یک Mismatch در حد تک نوکلیوتید در ژنوم( در محل اتصال پروب ها) وجود داشته باشد، پروب ها متصل نشده و هیچ پیکی ( Pick )   مشاهده نمی شود. از این اختصاصیت می توان برای شناسایی جهش های نقطه ای (  Point Mutation )، مشابه تکنیک ASO بهره برد.

نکته 4 : پروب های MLPA برای مناطقی از ژنوم طراحی شده اند که احتمال پایین تری برای وجود پلی مورفیسم و SNP دارند، اما زمانی که پروب برای اولین بار در یک جمعیت خاص مورد استفاده قرار می گیرد باید بررسی کرد که این کاهش پیک ( Pick ) به دلیل وجود  SNP در آن منطقه بوده یا رخداد حذف؟

  • معمولا" تمایز بین وجود  SNP یا رخداد حذف در منطقه مورد بررسی با تجربه کاری به دست می آید، مثلا" حذف های آلفا آنقدر بزرگ هستند که چندین پروب را درگیر می کنند و اگر در حین کار متوجه حذفی در حد یک پروب باشیم احتمال وجود SNP در آن منطقه بالا میرود، در این زمانSequencing  توصیه می شود. اما در بیماری هایی مانند DMD (اختلال دوشن) که برای هر اگزون آن یک پروب وجود دارد و علت عدم اتصال پروب برای هر دو حالت (وجود  SNP یا رخداد حذف ) وجود دارد، در اینجا پس از آنکه در اگزون و منطقه مورد بررسی پیک ( Pick ) مشاهده نشد می بایست روی PCR Product  نمونه مورد بررسی یک PCR گذاشت و اگر واکنشی رخ نداد قطعا" حذف بوده است.

با در نظر داشتن نکات بالا برگردیم به ادامه تکنیک....

در MLPA  چهار نوع پروب وجود دارد:

1 ) اختصاصی برای بررسی نواحی Copy Number Variation

2) در اکثر کیت ها یک جفت پروب  X و Yبرای تعیین جنسیت وجود دارد

3) پروب مرجع، رفرانس یا کنترل: این پروب در واقع نواحی از ژنوم است که در تمام افراد می بایست نرمال کار کند و اگر در یک نمونه این پروب ها غیر طبیعی کار کرده باشند مشخص است که MLPA   خوب کار نکرده است

4) پروب های D-Q (D-Q Probe): برای بررسی  Denaturation وQuality  نمونه هستند و سایز زیر 100 دارند،  در ارتباط باD-Probe  ها باید گفت که سایز حدود 40-50-60 دارند، اگر پیک این ها از 3/1 پیک پروب های اصلی بیشتر باشد نشان دهنده آن است که Denaturation در موارد D-Probe پایین بوده و جواب نهایی MLPA  قابل قبول نیست. Q-Probe برای بررسی Quality  نمونه است و تقریبا" سایز 92 (همیشه سایز کمتر از 100 است) دارند و اگر ارتفاعشان از D-Probe بیشتر باشد یعنی کیفیت نمونه خوب نیست. سایز پروب های رفرانس به مانند پروب های اختصاصی بالاتر از 100 می باشد. سایز پروب های تعیین جنسیت X و Y حدود 118 می باشد. تمام پروب ها در ProbMix قرار دارند و همزمان با هم در نمونه ریخته می شوند. برخی از پروب های Quality  هیچ منطقه مکملی در ژنوم ندارند و فقط یک Fragment  با سایز مشخص برای انجام PCR هستند.

نرم افزار مورد استفاده برای آنالیز MLPA  ؛ Gene Marker می باشد که از سایت Soft Genetics دانلود می شود.

آنالیز MLPA  :

در ابتدا نرم افزار Gene Marker را باز می کنیم، سپس قسمت Open Data نرم افزار باز می شود و از آیکون Open Data داده خام با فرمت  FASTA (فرمتی که دستگاه Genetic Analyzer  می دهد) را Add می کنیم. پس از آن نمونه ها را Run  می کنیم.

در اینجا می بایست پنل ( Panel  ) را مشخص کنیم، همچنین سایز استانداردی که در دستگاه کاپیلاری استفاده شده را نیز تعیین کنیم.

 

1. Internal

2. Population

صفحه بعدی Data Process  است و سپس در Setting  متد (Method) مورد مطالعه را باید وارد کنیم.

 

در شروع کار از Population استفاده کرده و در حین کار از پروب رفرانس استفاده می کنیم، در این جا نمونه ها با شرایطی که برای نرم افزار تعریف کردیم Run  شدند.

  • پنل ( Panel  ) چیست؟ به مانند شناسنامه یا شاخص است که کیت تشخیصی مورد استفاده چه پروب هایی و در چه سایزهایی دارد. مثلا" سایزهای  110، 120، 130 یا 140 در چه مناطق و اگزون هایی قرار می گیرند و در واقع پنل مذکور در کیت آمده است و تعیین می کند هر Fragment  در چه منطقه ای از ژنوم قرار گرفته است. در Size Standard  به موارد مختلفی اشاره شده که اگر نمونه خودمان سایز استاندارد نداشت باید از اینترنت دانلود شود.
  •  اگر یک کیت را خریداری کردیم و پنل مطابق آن تعریف شد، ممکن است نسخه  جدید آن کیت در خرید بعدی تغییر کند که باید پنل جدید را از اینترنت update  کرد.

ادامه آنالیز:

قبل از آنکه وارد آنالیز شویم از آیکون Tools  وارد Panel Editor  می شویم ( هر دفعه که نمونه ها وارد دستگاه کاپیلاری می شوند در حد 2-1 نوکلیوتید ممکن است تغییر پیک نشان دهند و در صورتی که برای نرم افزار سایز 130 را تعریف کرده باشیم ممکن است Deletion را در 129 یا 131 ذکر کند پس در اینجا پیک ها را به اندازه همان 2-1 نوکلیوتید تغییر می دهیم.)

همانطور که قبلا" ذکر شدپیک با سایز 60-50 مربوط به Primer Dimer  است. پروب های زیر سایز 100 نیز مربوط به D-Q Fragment  هستند و سایزهای بالاتر از 110 مربوط به پیک های اصلی می باشند. البته باید توجه داشت که پیک های 150-180 مربوط به تعیین جنسیت می باشند.

در اینجا به مرحله MLPA Analyze می رسیم، Method  بررسی براساس MLPA Ratio  است. ارتفاع هر پیک را اندازه می گیریم و براساس ارتفاع ها به هر پیک یک نسبتی می دهیم. در واقع روش کمی است. پروب های اختصاصی که اطلاعات مدنظرمان را می دهند در صورتی که در Threshold نرمال قرار بگیرند (سالم باشند) با رنگ سبز و در صورتی که خارج از این Threshold باشند (  0/75 <          < 1/35  )  با رنگ قرمز مشخص می گردند.

  • اگر عدد تغییر یافته حول و حوش 5/0 باشد حذف هتروزیگوت
  • اگر عدد تغییر یافته حول و حوش 0 باشد حذف هموزیگوت
  • اگر عدد تغییر یافته حول و حوش 5/1 باشد مضاعف شدگی ( Duplication )

اگر در کل نمونه بیمار پیک ( Pick ) وجود نداشت Score: 0

 

نمونه هایی که Score بالای 50 دارند قابل قبول ( Reliable ) هستند اما معمولا" نمونه های Score بالای 20 را نیز مورد بررسی قرار می دهند. این چیزی را که نرم افزار برای ما نشان داد براساس Population Normalize  است و ما این نتایج را برای بررسی وضعیت نرمال ها نیاز داریم پس در Population Normalize وضعیت نمونه ها را بررسی می نماییم.

1) در ابتدا نگاه می کنیم که پروب رفرانس چطور کار کرده است؟

 

 

 

اگر پروب رفرانس در گراف بالا که در نرم افزار سومین گراف مشخص شده است بین دو خط باشد ( محدوده نرمال) از اولین سد فیلتر گذشته ایم.

حالا سراغ پروب های اختصاصی می رویم آنها نیز باید حول وحوش نرمال (پروب رفرانس) کار کرده باشند که در اینصورت نرمال بودن را تایید می کنیم، اگر نمونه بیمار دچار ناهنجاری باشد این ناهنجاری باید در یک رنج قرار داشته باشد یعنی مربع ها به یک موازات کنار هم باشند و بصورت مواج قرار نگرفته باشند چون در اینصورت در دقت کار انجام شده شک بوجود می آید و نتیجه نهایی قابل قبول نیست.

پس از این مرحله که با Population Normalize  کار کردیم از آیکون Ctrl  ( Control Sample Selection ) وارد می شویم و قسمت Population Normalize غیرفعال می کنیم چون دیگر به این بررسی نیاز نداریم و در این مرحله نرمال های مورد تایید انتخاب  شده اند.  پس از این مرحله شروع به آنالیز تک تک نمونه ها می کنیم و چند مورد را باید چک کنیم.

شکل ظاهری پیک ها می بایست خوب باشند و پیک استاندارد باید فاقد سایه بوده و ارتفاع پایینی داشته باشد. پروب های رفرانس نیز می بایست در Threshold  تعریف شده، باشند. در صورتی که مربع قرمز رنگ در نمونه بیمار دیدیم روی آن کلیک می کنیم تا از حذف یا مضاعف شدگی مطمین شویم. چون ممکن است چیزی که اینجا می بینیم واقعی نباشد و تغییر 2-1 نوکلیوتید در دستگاه کاپیلاری سبب حذف کاذب شده باشد. اگر قرمز ها در میانگین  نرمال قرار دارند اما Sample  آبی فاقد پیک است حذف تایید می شود(حذف هموزیگوت)

 

تشخیص افراد ناقل و مبتلا به اختلال SMA از طریق روش MLPA :

تکنیکMLPA بهترین روش برای شناسایی افراد ناقل و مبتلا به اختلال SMA است. تا قبل از این روش با استفاده از سه تکنیک  ARMS/RFLP/Multiplex QPCR به شناسایی افراد مبتلا و ناقل می پرداختند ولی با ظهور تکنیک MLPA فقط با کمک دو روش MLPA/Multiplex QPCR  در مدت زمانی کوتاه و با دقت بیشتر تشخیص بیماران و افراد ناقل SMA صورت می گیرد. در بیماری SMA دو ژن SMN1 و SMN2 مورد بررسی قرار می گیرند و جهش ها و تعداد نسخه هر یک از آنها در تشخیص نهایی اختلال مزبور اهمیت زیادی دارد.

نکته 1: ژن های SMN1 و SMN2 تقریبا" با یکدیگر یکسان هستند و بر روی جایگاه کروموزومی 5q11.2-13.3 قرار دارند. (  Survival motor neuron 1 gene at chromosome 5q11.2-13.3)

                                                                                                                                                                             

شناسایی حذف هموزیگوت اگزون 7 ژن SMN1 ( در برخی مقالات علمی تعبیر به SMNt  تلومری یا عملکردی می شود) تست تشخیصی و قابل قبول بیماری آتروفی ماهیچه ای نخاعی (spinal muscular atrophy= SMA ) می باشد. هر چند محصول پروتیینی ژن SMN2 (در مقالات علمی تعبیر به SMNc  یا سانترومری نیز می شود) رونوشت کوتاه تری از ژن SMN1 می باشد و در صورت بیان کامل ژن SMN1 نیازی به فرآورده این ژن نمی باشد اما در صورت حذف هموزیگوت اگزون 7 ژن SMN1 تعداد نسخه های موجود ژن SMN2 تعیین کننده فنوتیپ اصلی بیمار است. در جمعیت نرمال، افراد واجد 0 تا 3 نسخه از ژن SMN2 هستند و تقریبا" 15-10% از این جمعیت ( که نرمال و سالم از نظر اختلال SMA هستند) هیچ نسخه ای از این ژن ندارند. همانطور که ذکر شد، در صورت حذف هموزیگوت اگزون 7 ژن SMN1، وجود تعداد نسخه های ژن SMN2  موجب ملایم شدن فنوتیپ بیمار می گردد و به جای شکل شدید اختلال که SMA TYPE I نامیده می شود اشکال خفیف تر بیماری یعنی SMA II ,III,IV  بسته به تعداد نسخه  موجود SMN2  ایجاد می گردد.

                                             Copy Number Of SMN2
      2-1                                                                                                   SMA Type  I
       3                                                                                                    SMA Type  II
 SMA Type  II                                                                                                  3or4  
در سه فرد از اعضای یک خانواده حذف هموزیگوت ژن  SMN1 تایید شد اما به دلیل آنکه در ژنوم هر سه پنج نسخه از ژن SMN2 وجود داشت، هر سه  فرد این خانواده از نظر این اختلال کاملا" سالم و بدون علایم بالینی بودند.

                                                                                                                                                                                      

همان طور که پیش تر ذکر گردید، حذف اگزون 7 ژن SMN1 در اکثر بیماران مبتلا به SMA  بدون در نظر گرفتن شدت بیماری وجود دارد و در واقع تعیین کننده شدت بیماری وجود یا نبود تعداد نسخه های  SMN2 است. اگرچه تغییر C به T در اگزون 7 ژن SMN2 تغییری در توالی و نوع اسید آمینه پروتیین نهایی ایجاد نمی کند اما موجب از بین رفتن یک تقویت کننده پیرایش اگزونی Exonic Splicing Enhancer =ESE)) و بوجود آمدن یک توالی خاموش کننده اگزونی Exon Silencer Element =ESS)) شده که نتیجه این تغییر حذف اگزون 7 این ژن است. در نتیجه این حذف،  پروتیین رمزدهی شده (SMN Δ 7) به خوبی الیگومریزه نشده و ناپایدار می باشد. در بیش از  95 درصد بیماران مبتلا به نوع 3-1 این اختلال، حذف هموزیگوت دو اگزون 7 و 8  هر دو نسخه تلومری SMN رخ داده است. تاریخچه این اختلال به سال 1999 بر می گردد زمانی که جایگاه ژنی  SMA را که حاوی دو نسخه وارونه از ژن های SMN1 و SMN2 بر روی بازوی بلند کروموزوم 5  بود و حدود  500 kb  طول داشت، شناسایی کردند.

دو ژن دیگر به نام های NAIP  و  P44 نیز در این جایگاه ژنی قرار دارند که جهش هایی از این دو ژن در کمتر از 5 درصد موارد رخداد این اختلال گزارش شده است. ژن های تاثیر گذار در ایجاد اختلال SMA  در یک ناحیه ژنومی محتوی تعدادی توالی وارونه و تکراری قرار گرفته اند، ژن اصلی و کاندید این بیماری ژن SMN  بوده که حاوی 9 اگزون است و یک کدون پایان ( Stop Codon ) در نزدیک انتهای اگزون 7 خود دارد. در جایگاه کروموزومی 5q11.2-13.3 دو نسخه از SMN بصورت وارونه قرار دارد؛ نسخه تلومری یا SMN1 که ژن تعیین کننده اختلال SMA  (SMA determining gene) است و نسخه سانترومری یا SMN2 . این دو ژن به شدت با یکدیگر همولوگ بوده  و تنها در پنج جفت باز از هم تفاوت دارند( از این تفاوت برای تمیز  SMN1 از SMN2 استفاده می شود).

نکته پراهمیت دیگر آن است که توالی رمزگذار ژن SMN2 تنها در یک نوکلیوتید از SMN1 تفاوت دارد

 840 C >T) ) که این نوکلیوتید تغییری در آمینواسید ایجاد نمی کند اما موجب رخداد یک Alternative Splicing  در توالی ژنی SMN2  شده که در نتیجه آن اگزون 7 این ژن حذف می گردد.  بیماری SMA  ناشی از کاهش محصول پروتیینی ژن SMN بوده و یک ارتباط قوی بین شدت بیماری و سطوح فرآورده پروتیینی وجود دارد. تعدادی بیمار مبتلا به SMA   مشاهده شده است که جهش هایی در ژن SMN1 دارند و تنها واجد حداقل یک نسخه عملکردی از ژن SMN2 می باشند، پروتیین SMN این بیماران بصورت نسبی عملکرد دارد اما نمی تواند کمبود فرآورده ناشی از بیان آلل های نرمال SMN1 را جبران نماید (فنوتیپ خفیف تر نسبت به موارد حذف).

نکته 2: بیماری وردینگ-هافمن ( Werdnig Hoffman ) یا SMA Type  I

این نوع از SMA شدیدترین شکل بیماری بوده و علایم آن از قبل از شش ماهگی بروز می کنند و طول عمر بیمار حدود  3-2 سال می باشد. این شیرخواران هرگز مهارت و قدرت نشستن، گردن گرفتن، خزیدن و راه رفتن را پیدا نمی کنند و معمولا" دچار زجر تنفسی و مشکل در بلع هستند. این شکل از اختلال 60% بیماران مبتلا به SMA را شامل می گردد. اکثریت بیماران مبتلا به SMA Type  I  واجد یک یا دو نسخه از ژن SMN2 می باشند.

 

نکته 3: تشخیص افراد ناقل بستگی به تعیین تعداد نسخه های ژن SMN1 دارد ( اختلال SMA  توارث اتوزومی مغلوب داشته و در صورت نبود هر دو آلل نرمال، بیماری بروز می کند و در صورتی که فقط یک آلل عملکردی از ژن مزبور وجود داشته باشد بیمار حامل بدون علامت بیماری خواهد بود).

نکته 4: حذف هموزیگوت هر دو ژن SMN1  وSMN2  تا بحال گزارش نشده است، احتمالا" فقدان بیان هر دو ژن کشنده در اوایل رویانی بوده و به تولد زنده منجر نمی شود.

نکته 5: اگزون های 5 و 6 ژن NAIPt  در تقریبا"  50 درصد موارد SMA نوع 1 و 18 درصد موارد SMA نوع 2 و3 حذف شده است.

نکته 6: فقدان یا کمبود ژن P44t   در 73 درصد موارد SMA  نوع 1 و 7 درصد موارد SMA  نوع 2 مشاهده شده است.

 

پته 3: تشخیص افراد ناقل بستگی به تعیین تعداد نسخه های ژن SMN1 دارد ( اختلال SMA  توارث اتوزومی مغلوب داشته و در صورت نبود هر دو آلل نرمال، بیماری بروز می کند و در صورتی که فقط یک آلل عملکردی از ژن مزبور وجود داشته باشد بیمار حامل بدون علامت بیماری خواهد بود). 

نکته 4: حذف هموزیگوت هر دو ژن SMN1  وSMN2  تا بحال گزارش نشده است، احتمالا" فقدان بیان هر دو ژن کشنده در اوایل رویانی بوده و به تولد زنده منجر نمی شود.
نکته 5: اگزون های 5 و 6 ژن NAIPt  در تقریبا"  50 درصد موارد SMA نوع 1 و 18 درصد موارد SMA نوع 2 و3 حذف شده است.
نکته 6: فقدان یا کمبود ژن P44t   در 73 درصد موارد SMA  نوع 1 و 7 درصد موارد SMA  نوع 2 مشاهده شده است.
 
 
 
 

Information resources

  1. Gene Tests (www.genetests.org)
  2. Gene Cards For SMN1      
  3. NiceProt View of Swiss-Prot: SMN, accession number Q16637
  4. http://us.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?Q16637
  5. Spinal Muscular Atrophy Net (www.affari.com/smanet
  6. Families of Spinal Muscular Atrophy (FSMA)  (www.fsma.org)

جهت درخواست آنالیز و انجام کامل MLPA ، خواهشمند است از قسمت ثبت سفارش اقدام بفرمائید.