تعیین توالی DNA

تعیین توالی DNA

 

فردریک سانگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ روش توالی‌یابی سانگر را بر پایه خاتمه دادن رشته دی اکسی نوكلئوتيد توسط DNA پلی مراز در فرآیند همانندسازی DNA  ابداع کردند و به دلیل این اختراع در سال 1980 جایزه نوبل شیمی را به خود اختصاص دادند. بعدها این تکنیک توسط شرکت Applied Biosystems بصورت تجاری درآمد. این روش برای تقریباً 40 سال از مهم ترین روش های تعیین توالی DNA  بوده است. اخیراً روش توالی‌یابی دیگری به نام «(NGS( Next Generation Sequencing » برای  بررسی نواحی بزگتری از ژنوم با صرف زمان کوتاهتر و در بعد گسترده تری  مورد استفاده قرار گرفته است. با این وجود، توالی‌یابی سانگر همچنان برای بررسی نواحی کوچکتر ژنوم و یا تایید نتایج حاصل از توالی یابی NGS از اهمیت قابل توجهی برخوردار است.  

توالی یابی DNA  با استفاده از روش  Sanger Sequencing  :

مبنای این تکنیک استفاده از نوکلئوتیدهای ویژه ddNTP )ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)  است که فاقد گروه OH  بر روی کربن ʹ3 خود می باشند. به این نوکلئوتید ها خاتمه دهنده برگشت ناپذیر همانندسازی گفته می شود که با رنگ فلورسانس نشان دار شده اند. در روش توالی یابی سانگر، به ازای یک به ده از این ddNTPها در مقابل نوکلئوتید های معمولی (dNTP) در سنتز DNA استفاده می شود.
در روش توالی یابی سانگر فقط نوکلئوتیدهای ddNTP نشان دار به مجموعه مواد مورد نیاز برای همانندسازی، اضافه شده اند و بقیه مسیر با همان روش مرسوم Cycle-Sequencing (با دستگاه ترموسایکلر و آغاز تک رشته ای شدن DNAژنومی) آغاز می گردد. با توجه به توالی DNA نوکلئوتیدها یکی یکی به رشته اضافه می گردند همانگونه که در بالا ذکر گردید، در صورتی که dNTP به رشته در حال همانندسازی اضافه گردد رشته طویل تر شده و اگر ddNTP بجای  dNTP به این رشته در حال تکثیر اضافه گردد، خاتمه زنجیره رخ می دهد. 
بدین صورت قطعاتی با طول های متفاوت که در انتها نشان دار شده اند خواهیم داشت. این قطعات براساس سایز بر روی ژل الکتروفورز در دستگاه Genetic Analyzer قرار می گیرند و با توجه به اینکه سبک ترین قطعات با سرعت بیشتری به پایین ژل هدایت می شوند در نتیجه خوانش نوکلئوتیدها از پایین ترین قطعات ژل صورت می پذیرد. برای روشن تر شدن این مطالب این مراحل بصورت شماتیک در ذیل آورده شده است: 
                                          
 
سپس، قطعات تکثیر شده، توسط دستگاه  Genetic-Analyzer   ABI  3130XL   ، فرایند خوانش صورت میگیرد.
 
                                                              
 
 
 
                                                                     
 
 
 
 
 
 
                                   
و در نهایت توالی مورد بررسی به شکل زیر در نرم افزار کروماس جهت آنالیز در اختیار کارشناس قرار داده می شود. 
    
                            
 
                                                                                       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
متاسفانه در برخی مواقع نتایج حاصل از تعیین توالی DNA رضایت بخش نمی باشد، مهم ترین مشکلات مشاهده شده شامل؛

1.  خوانش صورت نگیرد ( Failed sequence  ) ؛ 

                              

 
                                                        

    

 

                                    دلیل بروز مشکل                                راه حل

  *جایگاه اتصال برای پرایمر وجود نداشته است 

  *تکثیر غیراختصاصی و وجود باندهای اضافی در ژل   

  *انتقال مجدد پرایمر به شرکت

  *کیفیت DNA در واکنش PCR  پایین بوده است

  *میزان DNA مورد استفاده ناکافی بوده است

  *تخلیص مجدد DNA

* بررسی کیبفیت DNA با استفاده از نانو دراپ و انجام PCR

  *وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و EDTA   *پاکسازی (  Purification  ) نمونه DNA از آلودگی ها

  *شرایط زنجیره سرد پرایمرها در موقع انتقال به آزمایشگاه رعایت نشده باشد 

  *انتقال مجدد پرایمر به شرکت
امکان مشاوره علمی رایگان توسط کارشناسان شرکت نیاژن وجود دارد  

2. پیک های کوتاه و ضعیف مشاهده گردد (Weak sequence) ؛

                     
 

 

 

 

 

 

 

                                     دلیل بروز مشکل                                                                                         راه حل             

  *ناکافی بودن میزان پرایمر

  *ناکافی بودن میزان DNA

*تغییر مقادیر پرایمر و یا DNA
        *وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و  EDTA *پاکسازی( Purification ) نمونه DNA از آلودگی ها

3. ابتدای توالی خوانش شود، اما پس از آن پیک نداشته باشیم (Signal dropped soon after read start) ؛

                      
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                      دلیل بروز مشکل                                           راه حل

*تشکیل دایمر پرایمر یا وجود ساختارهای ثانویه در پرایمر 

* میزان GC پرایمر یا توالی DNA بالا باشد

      *عدم تناسب بین غلظت پرایمر مورد استفاده به DNA

* طراحی مجدد پرایمر که فاقد hairpin یا ساختارهای ثانویه باشد

 *  تغییر ست آپ PCR برای توالی با GC بالا

       * تصحیح نسبت غلظت پرایمر به DNA

4. حذف پیک ها پس از یک خوانش کوتاه از یک ناحیه هموپلی مر(Signal dropped after homopolymer region ):

                                                                                                                                                                                                           :Poly C/T
 
                    
                                                                                                                                                                                             
 
 

                                                                                                                           

                                                                                                                                                                                                           :PolyG/T                     

 

 

 

 

 

 

 

                            دلیل بروز مشکل                                    راه حل          
      *بدلیل هموپلی مر بودن توالی پدیده Replication slippage رخ داده است                                

 تغییر ست آپ PCR از نظر شرایط cycle sequencing conditions و purification و انجام مجدد PCR

       *طراحی پرایمر اختصاصی برای نواحی هموپلی مر

5. پیک ها بصورت در هم فشرده باشند (Signal Top heavy) :

                 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                               دلیل بروز مشکل                                                 راه حل

*غلظت بالای DNA یا پرایمر مورد استفاده

      *وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و  EDTA

   * اندازه گیری غلظت DNA و پرایمر قبل از انجام  PCR

   * یک مرحله اضافی شستو تا آلودگی DNA  با اتانول مرتفع شود

   *  شست و شوی DNA در بافرهای Elution

(10mM Tris-Cl, pH 8.5) یا nuclease free H2O

  6. خوانش پر از Noise  باشد (Noisy read)

                                                                                         A: Overall noisy sequence with weak raw signals
                   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                      دلیل بروز مشکل                                          راه حل

 *کافی نبودن DNA الگو

 * وجود مهارکننده های PCR

 * نامناسب بودن دمای annealing پرایمرها

 *عدم کفایت اتصال اولیه پرایمرها به DNA الگو

* اندازه گیری غلظت DNA و پرایمر قبل از انجام  PCR

 * تغییر ست آپ چرخه PCR و ران مجدد نمونه ها

* رقیق کردن پرایمر

                                                                                              B: Overall noisy sequence with strong signal

                  
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                   دلیل بروز مشکل                                                            راه حل

  * استفاده همزمان از  DNA های متفاوت بعنوان الگو                              

 * آلوده بودن DNA

 * استفاده از پرایمرهای آلوده

        *وجود چندین جایگاهاتصال غیراختصاصی برای پرایمر 

 *  تخلیص دوباره ADN

 * اطمینان از استفاده یک پرایمرفوروارد یا ریورس نه هر دو در هنگام انجام توالی یابی

 * بررسی وجود آلودگی در پرایمر یا DNA

        * بررسی تاریخ انقضای پرایمر مورد استفاده

7. خوانش با تاخیر بوده و  وجود پیک های نامتعارف قبل از خوانش صحیح توالی:

                 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
              
                                                  دلیل بروز مشکل                                     راه حل    

*وجود مشکل در کاپیلاری دستگاه Genetic Analyzer

       *احتمال وجود آلودگی در DNA یا PCR-Product

   *رفع مشکل کاپیلاری

  *پاکسازیPurification نمونه  DNA از آلودگی ها

8. وجود پیک های ناخواسته بلند در خوانش (Large raw signal spike ):                                

                                        دلیل بروز مشکل                                                                                                                          راه حل                                                             
  *وجود مشکل در کاپیلاری دستگاه    Genetic Analyzer  *رفع مشکل کاپیلاری
 

گروه ژنتیک پزشکی نیاژن نور با دارا بودن پیشرفته ترین تجهیزات و نیز بهره بردن از کادری مجرب و کارشناسانی توانمند امکان انجام توالی یابی DNA را با بالاترین کیفیت و کمترین هزینه بصورت بومی دارا بوده و نیازی به ارسال نمونه به خارج از کشور ندارد.

خواهشمند است جهت ارسال نمونه از قسمت ثبت سفارش اقدام بفرمائید.